Realización de PCR para detección de COVID-19

El virus SARS-CoV-2 es un virus ARN simple de polaridad positiva perteneciente a la familia de los Coronavirus. Este virus es responsable de la enfermedad COVID-19, declarada como pandémica en marzo de 2020 por la Organización Mundial de la Salud. La COVID-19 es una enfermedad que afecta fundamentalmente a las vías respiratorias, dando lugar a síntomas como tos seca o fiebre, y en los casos más graves a neumonía bilateral que en ocasiones evoluciona al fallecimiento del paciente. 

La especial importancia del virus SARS-CoV-2 recae en su velocidad de transmisión o R0, pues presenta un R0=2-6,47, lo que indica que cada persona infectada puede transmitir el virus a entre 2 y 6,47 personas sanas, a través de las gotículas que se liberan al estornudar, toser o hablar, favoreciéndose su rápida diseminación entre la población. Así, para contener la transmisión, además de adoptar medidas sanitarias, se debe disponer de métodos de detección eficaces, que permitan localizar a las personas portadoras del virus (infectadas) y aislarlas del resto de la población. 

¿Qué es la RT-PCR?

Uno de estos métodos es la Reacción en Cadena de la Polimerasa de transcripción inversa en Tiempo Real (RT-PCR), que tiene por objetivo detectar infección activa por SARS-CoV-2.

La RT-PCR para la detección de SARS-CoV-2 es una técnica que detecta el material genético del virus, el ARN, de manera específica a partir de una muestra nasofaríngea o de saliva del paciente. 

Brevemente, la técnica emplea sondas marcadas con fluoróforos que se unen de manera específica a secuencias concretas del ARN del virus, permitiéndose la amplificación del ARN y su cuantificación por métodos fluorimétricos.

No obstante, para que la RT-PCR tenga éxito, el ARN del virus debe ser aislado previamente de la muestra, proceso que generalmente comprende los siguientes pasos: lisis celular; separación del ARN de otras macromoléculas como el ADN, las proteínas y los lípidos; y concentración del ARN extraído.

¿Cómo se realiza la prueba?

Para el aislamiento del ARN se parte de una muestra nasofaríngea o de saliva contenida en un tubo de 1,5mL. Tras la lisis celular, se procede a la extracción del ARN mediante precipitación con etanol, y al lavado de la muestra con distintos tampones de lavado. 

Para este paso, la muestra lisada se deposita en una columna de extracción acoplada a un tubo colector de 2 ml de capacidad, y se centrifuga durante 1 minuto a 8.000 rpm cada vez que se adicione un reactivo nuevo. Además, se recomienda realizar un paso de centrifugación adicional de 10 minutos a 13.000 rpm al final, para eliminar todo el etanol de la muestra, pues éste es un fuerte inhibidor de la RT-PCR. 

Finalmente, se procede a la elución del ARN contenido en la columna, empleando un tampón de elución y centrifugando la muestra de nuevo durante 1 minuto a 8.000 rpm. Una vez se ha extraído el ARN se realiza la RT-PCR, atendiendo a las instrucciones del fabricante en cada caso.

Para la realización de todos estos pasos de centrifugación necesarios podemos contar con la microcentrífuga Biocen 22. Con un rotor para trabajar con 24 muestras de 1,5-2 ml, puede programarse en un rango de trabajo de 100 a 15.000 rpm. También cuenta con una función que permite programar el equipo con cuenta atrás/creciente desde “0” o “set R.P.M./F.C.R.” lo que resulta muy útil para este tipo de procedimientos que precisan resultados reproducibles.

La RT-PCR, que es uno de los métodos más empleados para la detección de SARS-CoV-2, requiere como paso previo la extracción del ARN de la muestra, y cuando esta extracción se realiza mediante precipitación por etanol, los pasos de centrifugación resultan fundamentales.