Fraccionamiento subcelular para análisis por Western Blot

El Western Blot es una técnica que se emplea de manera rutinaria en muchos laboratorios, y que sirve para identificar la cantidad de una proteína concreta que hay en una muestra compleja de proteínas. Brevemente, la técnica se basa en la separación de proteínas mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida, la transferencia de las proteínas del gel a una membrana, y la detección de las proteínas inmovilizadas en la membrana mediante el empleo de anticuerpos.

¿Qué es el “fraccionamiento subcelular”?

Un ejemplo de aplicación de esta técnica es el análisis de la expresión de proteínas en los distintos compartimentos celulares (citoplasma, núcleo y otros orgánulos). 

Para ello, se realiza lo que se conoce como “fraccionamiento subcelular”, que brevemente consiste en aislar las proteínas y otras moléculas contenidas en los distintos compartimentos celulares. Más en detalle, para este fraccionamiento se emplean distintos tampones (“buffer”) con diferentes composiciones en sales y otros reactivos, que tienen por objetivo final romper las barreras tanto de la propia célula (membrana plasmática), como de los orgánulos celulares y del núcleo (membrana nuclear), dejando al descubierto su contenido. 

Así, se van alternando ciclos de incubación en hielo con el tampón, con ciclos de centrifugación (400g, 10 min, 4ºC) (Figura 1), obteniéndose como resultado el aislamiento de las distintas fracciones subcelulares (A=fracción citoplásmica, B=fracción de orgánulos, C=proteínas nucleares), que se emplearán para Western Blot .

El fraccionamiento subcelular permite analizar la expresión de las proteínas en los distintos compartimentos de la célula mediante Western Blot, y para realizarlo se requieren, además de los reactivos oportunos, ciclos de centrifugación. 

Durante la centrifugación hay que evitar el incremento de la temperatura de la muestra, por lo que es necesario una centrífuga refrigerada que asegure la estabilidad de la temperatura de la muestra. La microcentrífuga Biocen 22 R, cuenta con un programa de pre-enfriamiento con rotor girando y temperatura regulable, garantiza la temperatura durante el proceso de centrifugación y para mayor seguridad de la muestra, mantiene la refrigeración tras finalizar el proceso de centrifugación.