Análisis del nivel de calprotectina en pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal.

La calprotectina es una proteína que producen los neutrófilos y monocitos del intestino en situación de inflamación intestinal. Así, en algunas enfermedades inflamatorias intestinales, como por ejemplo la Enfermedad de Crohn, dichas células producen calprotectina, que se libera a la luz del intestino y se excreta junto con las heces.

La cantidad de calprotectina en heces ha demostrado ser un biomarcador eficaz tanto en el diagnóstico como en la evolución de la enfermedad inflamatoria intestinal, además de en la monitorización de la respuesta frente a distintos tratamientos.

El método ELISA sándwich

El método más utilizado para cuantificar la calprotectina en heces es el método ELISA sándwich. 

Brevemente, este método emplea anticuerpos que se unen de manera específica a la calprotectina, emitiendo una señal detectable que será directamente proporcional a la cantidad de calprotectina que haya en las heces. No obstante, para que esta cuantificación tenga éxito es necesario aislar previamente la calprotectina del resto de moléculas y detritos presentes en las heces, evitando así que éstos interfieran en la detección.

La extracción de calprotectina

El primer paso para extraer la calprotectina es tomar aproximadamente 100mg de heces y diluirlos 1:50 en tampón de extracción, teniendo en cuenta que 1g de heces se corresponde con 1mL en términos de volumen. 

Es decir:

100mg heces + 4900μl tampón de extracción = 5mL (tubos de 5mL) 

Para asegurar que el tampón de extracción se mezcla adecuadamente con la muestra de heces, los tubos de 5mL que contienen la mezcla se homogenizan durante aproximadamente 25 min. Seguidamente, se procede a la extracción de la calprotectina, centrifugando los tubos de 5mL durante 20 min a 10.000 rpm, manteniendo las muestras a una temperatura de entre 2-8ºC.

La centrifugación es un proceso exotérmico que produce calor debido a la fricción con el aire en el interior de la cámara de centrifugación de las diferentes partes del rotor, para llevar a cabo este paso de centrifugación, se necesita una centrífuga refrigerada como nuestros modelos Digicen 21 y Bioprocen 22 R que permiten la regulación de la temperatura de -20°C (-4°F) a 40°C (104°F) en pasos de 1°C.

Después de la centrifugación de los tubos, como resultado, las moléculas se separan en función de su densidad, dando lugar a la formación de dos fases, denominadas sobrenadante (que contiene la calprotectina) y sedimento. Así, tras la centrifugación se toma parte del sobrenadante y se diluye nuevamente 1:50 en un tampón de dilución.

Por ejemplo:

20μl sobrenadante + 980μl tampón de dilución = 5mL (en tubos de 5mL).

Finalizado este proceso se obtienen 5mL de muestra, con una dilución 1:2500, que contienen la calprotectina extraída. Por último, se transfieren 100μl de la muestra diluida 1:2500 a una placa de 96 pocillos, y se comienza el inmunoensayo, atendiendo a las instrucciones del fabricante en cada caso.

La centrifugación de la muestra de heces para extraer la calprotectina es un paso determinante para el correcto funcionamiento del inmunoensayo (ELISA), y por ende para la correcta detección de calprotectina, con la relevancia clínica que ello conlleva tanto en el diagnóstico como en el tratamiento de pacientes con enfermedades inflamatorias intestinales.